本发明涉及一种检测甘蔗梢腐病(F.moniliforme)温度敏感型小种gx2的方法,包括引物和探针组合的设计、提取病原真菌DNA、建立qPCR检测的反应体系、qPCR检测的反应程序和定量qPCR检测结果。本发明采用Taqman探针的实时定量PCR检测方法,具有灵敏度高,特异性好,所需要的DNA用量少的特点,可以实现对温度敏感型小种gx2的快速定量检测和小种的准确鉴定,可用于田间对甘蔗梢腐病温度敏感型小种gx2的诊断及检测,检测效率高。
1.一种利用分子检测方法检测甘蔗梢腐病(F.moniliforme)温度敏感型小种gx2的引物和探针组合FAM-gx2,其特征在于所述引物和探针组合为:引物:FAM-gx2-F6:5’-TCATTTCAACCCTCAAGCCC-3’FAM-gx2-R6:5’-GAGACCGCCACTAGATTTCG-3’探针:FAM-gx2-P6:5’-CGCCGATCCCCAACACCAAAC-3’;上述Taqman探针的5’端、3’端分别用FAM报导荧光染料和BHQ-1淬灭基团标记。
2.一种如权利要求1所述的引物和探针组合检测甘蔗梢腐病温度敏感型小种gx2的方法,包括提取病原真菌DNA、建立qPCR检测的反应体系、qPCR检测的反应程序、定量qPCR检测,其特征在于:(1)提取病原真菌DNA:采集甘蔗梢腐病样品,经分离纯化培养病原菌的样品提取病原菌DNA;或直接提取病健交界处的叶片DNA;(2)建立qPCR检测的反应体系:qPCR检测的反应体系为1/10体积的10倍PCR反应缓冲液;dNTP各0.1~0.5mmol/L;Taqxa0DNA聚合酶0.1~5国际单位;分离纯化的DNA模板液0.1~5μl;一个组合的引物和探针,各0.1~2nmol/L;加无菌去离子水使总体积达到10~100μl;(3)qPCR检测的反应程序:qPCR检测的反应程序为:90-100°C30-60s;90-100°C5-30s,50-70°C20-90s,20~50个循环,在每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测,荧光模式设为FAM;(4)定量qPCR检测结果:qPCR检测结果Ct值为0,表示样品未检出甘蔗梢腐病温度敏感型小种gx2。技术领域
本发明涉及一种植物病害的检测方法,具体涉及一种检测甘蔗梢腐病(F.moniliforme)温度敏感型小种gx2的方法,属于生物技术领域。
背景技术
甘蔗梢腐病为真菌性病害,该病病原菌为镰刀菌(F.moniliforme),多发生在高温多湿的6~9月。带病种苗、患病植株和土表上病残枯株是病害的初次侵染来源。病菌的分生孢子随风雨、气流传播,降落在梢头心叶上,依靠心叶水分,在条件适宜时萌发长出芽管侵入心叶幼嫩基部,再侵入生长点附近的蔗茎,随后病部产生分生孢子再行重复侵染。发病初期幼叶基部褪绿黄化,后叶片变窄、显著皱褶、扭缠或短缩,叶片上红褐色纵向条纹裂开成为破损叶,严重者呈畸形;感染叶鞘形成红色坏死斑或梯形病斑;为害生长点引起顶腐及幼轴坏死;病茎呈红褐色平行纵裂的梯级,有许多如刀割状的横向裂口,变黑褐色,节间弯曲。最近20多年,随着新台糖系列品种(ROC10、ROC16、ROC22)的大面积种植,品种单一化造成了梢腐病的逐年加重,目前发病率达到10%以上,最高达到60%。特别是在夏季高温多雨季节发生的梢腐病,目前在秋冬季也时有发生。从2012年开始,课题组通过对中国大陆甘蔗各产区的梢腐病调查采样及病原菌的生物地理学研究,对所有采集样品的病原菌分离培养,经形态学鉴定和分子生物学鉴定,以ITS序列聚类分析,初步鉴定中国大陆甘蔗梢腐病病原主要是单一种类镰刀菌(F.moniliforme),但有两个小种gx1和gx2。不同小种的培养研究表明,gx1和gx2对温度的敏感性完全不同,gx2在高温条件下(高于28°C)基本停止生长,而在低于20°C下,其生长明显快于gx1。说明gx2是温度敏感型的小种,与最近几年梢腐病在国内的发生,特别是秋冬季节的发生密切相关。为此,如何对中国高温敏感型甘蔗梢腐病原小种gx2进行快速的检测鉴定,对研究梢腐病病原菌分化和病害防治具有十分重要的意义。
发明内容
本发明目的是提供一种检测甘蔗梢腐病(F.moniliforme)温度敏感型小种gx2的方法。所述甘蔗梢腐病温度敏感型小种gx2,是指引起我国甘蔗梢腐病,特别是在秋冬季发生的病原小种gx2,具有在温度高于28°C下不能生长的对高温敏感的病原小种,其检测鉴定特征序列为:GAGACCGCCACTAGATTTCGGGGCCGGCTTGCCGCAAGGGCTCGCCGATCCCCAACACCAAACCCGGGGGCTTGAGGGTTGAAATGACGCTCGAACAG。为了实现上述目的,本发明的甘蔗梢腐病温度敏感型小种gx2的分子检测方法,首先是依据gx2小种的特征序列,设计用于实时定量PCR的若干引物和Taqman探针组合FAM-gx2。一种利用分子检测方法检测甘蔗梢腐病温度敏感型小种gx2的引物和探针组合FAM-gx2,其特征在于所述引物和探针组合为下列6个组合中的1个组合:FAM-gx2第一组:引物:FAM-gx2-F1:5’-CTGATCCGAGGTCAACATTCAG-3’FAM-gx2-R1:5’-GCAGCTTCCATTGCGTAGTA-3’探针:FAM-gx2-P1:5’-CGCGTACCAGTTGCGAGGGTTT-3’;FAM-gx2第二组:引物:FAM-gx2-F2:5’-ACTACTACGCAATGGAAGCTG-3’FAM-gx2-R2:5’-AGCGTCATTTCAACCCTCAA-3’探针:FAM-gx2-P2:5’-CAGCGAGACCGCCACTAGATTTCG-3’;FAM-gx2第三组:引物:FAM-gx2-F3:5’-CGCAATGTGCGTTCAAAGAT-3’FAM-gx2-R3:5’-ACAACGGATCTCTTGGTTCTG-3’探针:FAM-gx2-P3:5’-TTTGCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’;FAM-gx2第四组:引物:FAM-gx2-F4:5’-GTACCAGTTGCGAGGGTTT-3’FAM-gx2-R4:5’-CCTGTTCGAGCGTCATTTCA-3’探针:FAM-gx2-P4:5’-CAGCGAGACCGCCACTAGATTTCG-3’;FAM-gx2第五组:引物:FAM-gx2-F5:5’-GGGCTTGAGGGTTGAAATGA-3’FAM-gx2-R5:5’-TCGATGAAGAACGCAGCAA-3’探针:FAM-gx2-P5:5’-AATCTTTGAACGCACATTGCGCCC-3’;FAM-gx2第六组:引物:FAM-gx2-F6:5’-TCATTTCAACCCTCAAGCCC-3’FAM-gx2-R6:5’-GAGACCGCCACTAGATTTCG-3’探针:FAM-gx2-P6:5’-CGCCGATCCCCAACACCAAAC-3’;上述Taqman探针的5’端、3’端分别用FAM报导荧光染料和BHQ-1淬灭基团标记。所述6个引物探针组合中,FAM‐gx2第六组为最佳。利用本发明的引物探针组合检测甘蔗梢腐病温度敏感型小种gx2的方法,包括提取病原真菌DNA、建立qPCR检测的反应体系、qPCR检测的反应程序、定量qPCR检测,其特征在于:(1)提取病原真菌DNA:采集甘蔗梢腐病样品,经分离纯化培养病原菌的样品提取病原菌DNA;或直接提取病建交界处的叶片DNA;(2)建立qPCR检测的反应体系:qPCR检测的反应体系为1/10体积的10倍PCR反应缓冲液;dNTP各0.1~0.5mmol/L;Taqxa0DNA聚合酶0.1~5国际单位;Taqman探针0.1~0.5mmol/L;分离纯化的DNA模板液0.1~5μl,;一个组合的引物和探针,各0.1~2nmol/L;加无菌去离子水使总体积达到10~100μl;(3)qPCR检测的反应程序:qPCR检测的反应程序为:90-100°C30-60s;90-100°C5-30s,50-70°C20-90s,20~50个循环,在每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测,荧光模式设为FAM;(4)定量qPCR检测结果:qPCR检测结果Ct值为0,表示样品未检出甘蔗梢腐病温度敏感型小种gx2。为了确保参试菌株为甘蔗梢腐病温度敏感型小种gx2,本发明通过离体纯化培养和ITS‐PCR方法对所采集的样品进行了病原菌小种gx2鉴定。本发明的优点:本发明以gx2小种的ITS序列易变异区设计特异引物和TanMan探针组合(FAM-gx2),通过qPCR技术可实现对温度敏感型小种gx2的快速定量检测和小种的准确鉴定。附图说明:图1不同稀释浓度的真菌DNA的qPCR反应扩增曲线,横坐标代表循环数Ct值,纵坐标代表荧光吸收值。图2真菌DNA浓度与Ct值的关系。横坐标(x)代表循环数Ct值,纵坐标(Y)代表DNA浓度。Y_gx2=-0.2997x+7.6674(R²=0.992)
具体实施方式
以下通过具体实施例对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。实施例1:供试菌株的分离和培养采集甘蔗梢腐病温度敏感型小种gx2田间发病植株上的典型病斑,进行病原菌的分离培养,具体程序如下:取病健交界处(病斑与健康部分的交界处)的植株组织,剪成边长为0.5cm大小的方块,在70%的酒精溶液中浸泡10秒钟,而后0.1%升汞中灭菌40秒,最后无菌水冲洗三次,置于灭菌滤纸上自然晾干,接于含氨苄青霉素100μg/ml的PDA培养基上,16-22°C倒置培养3-4天。菌丝长出后进行划线纯化培养,倒置培养2-3天后,挑取萌发的单菌落菌丝体再次划线纯化培养,纯化三代。采用无菌水稀释和水琼脂培养相结合的方法分离单孢,用弯曲的无菌玻璃棒将其均匀的涂抹在含有氨苄青霉素100μg/ml的水琼脂培养基上,倒置培养2-3天后,挑取单个孢子在含有含链霉素100μg/ml的查氏液体培养基中,于16-22°C下进行振荡培养,振荡速度为250r/min,该方法用于制备甘蔗梢腐病病原菌的菌丝体。实施例2:病原菌DNA的提取利用离心方法收集实施例1的菌体,即将菌液置于10ml的离心管中,4°C,13,000rpm,离心15min,去上清液后,将沉淀的菌体置于无菌超净工作台吹干。然后,对采用SDS法提取菌丝体的基因组DNA;首先,将离心收集多得到的菌丝体置于研钵,加入液氮并研磨成粉末,转移到1.5mlxa0eppendorf管;其次,加入DNA提取液和等体积的酚、氯仿、异戊醇(25:24:1)混合液,剧烈涡旋5min,离心收集上清液。最后,加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1),倒换数次充分混匀,4°C,11,000rpm,离心5min,取上清液至新的离心管中。重新抽提一次后(以便除去杂质,提高纯化效率),吸取上清液至新的离心管中,加入两倍体积预冷的无水乙醇(-20°C),-20°C冰箱放置30min左右。取出后12,000rpm,离心12min,于浓缩冷冻离心干燥仪上干燥,然后加入Rnase水溶液,37°C水浴消化1小时,(除去RNA杂质)。琼脂糖凝胶电泳和PCR扩增判断所提DNA质量后,-20°C保存备用。调整甘蔗梢腐病病温度敏感病原菌gx2小种的代表菌株YN41的样品DNA的终浓度为1,000μg/ml。实施例3:病原菌的引物和探针的设计根据甘蔗梢腐病温度敏感型小种gx2的特异序列设计实时定量PCR引物和Taqman探针组合(FAM-gx2),其中FAM‐gx2包括下述引物探针组中的一组:FAM-gx2第一组:引物:FAM-gx2-F1:5’-CTGATCCGAGGTCAACATTCAG-3’FAM-gx2-R1:5’-GCAGCTTCCATTGCGTAGTA-3’探针:FAM-gx2-P1:5’-CGCGTACCAGTTGCGAGGGTTT-3’FAM-gx2第二组:引物:FAM-gx2-F2:5’-ACTACTACGCAATGGAAGCTG-3’FAM-gx2-R2:5’-AGCGTCATTTCAACCCTCAA-3’探针:FAM-gx2-P2:5’-CAGCGAGACCGCCACTAGATTTCG-3’FAM-gx2第三组:引物:FAM-gx2-F3:5’-CGCAATGTGCGTTCAAAGAT-3’FAM-gx2-R3:5’-ACAACGGATCTCTTGGTTCTG-3’探针:FAM-gx2-P3:5’-TTTGCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’FAM-gx2第四组:引物:FAM-gx2-F4:5’-GTACCAGTTGCGAGGGTTT-3’FAM-gx2-R4:5’-CCTGTTCGAGCGTCATTTCA-3’探针:FAM-gx2-P4:5’-CAGCGAGACCGCCACTAGATTTCG-3’FAM-gx2第五组:引物:FAM-gx2-F5:5’-GGGCTTGAGGGTTGAAATGA-3’FAM-gx2-R5:5’-TCGATGAAGAACGCAGCAA-3’探针:FAM-gx2-P5:5’-AATCTTTGAACGCACATTGCGCCC-3’FAM-gx2第六组:引物:FAM-gx2-F6:5’-TCATTTCAACCCTCAAGCCC-3’FAM-gx2-R6:5’-GAGACCGCCACTAGATTTCG-3’探针:FAM-gx2-P6:5’-CGCCGATCCCCAACACCAAAC-3’上述Taqman探针的5’端、3’端分别用FAM报导荧光染料和BHQ-1淬灭基团标记。实施例4:Taqman荧光定量PCR检测利用实施例3的引物和Taqman探针组FAM-gx2的第六组进行温度敏感型小种gx2的荧光定量PCR检测:扩增反应总体积为20μL,其中上下游引物(FAM-gx2-F6/FAM-gx2-R6)500nM,探针(FAM-gx2-P6)250nM,10μlxa0Premixxa0LAxa0Taq(TaKaRa,大连),模板1μL,余下用双蒸水补足,置Roche480荧光定量PCR系统运行分析,在每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测,荧光模式设为FAM。反应程序为:95°C30s;95°C5s,60°C30s,40个循环。表1.依据F.moniliforme温度敏感型小种gx2序列设计的实时定量PCR特异引物和探针组合(FAM-gx2)检测田间样品 ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/> 表1结果表明,感gx2小种的样品可以检测到Ct值在16~25,但是没有感染gx2的样品的Ct值为0,说明Taqman探针FAM-gx2结合qPCR的方法,具有较好的特异性。实施例5:实时定量PCR的敏感性分析(1)Taqman探针qPCR的敏感性分析:调整甘蔗梢腐病原菌(F.moniliforme)温度敏感型的典型菌株YN41样品(gx2)DNA的终浓度为1,000μg/ml。进行10倍系列系稀释,分别用特异鉴定Taqman探针FAM-gx1进行qPCR检测,得到如图1所示的动力学曲线。结论:探针FAM-gx2对YN41的DNA样品在6个稀释度(10^-1~10^-5)的范围内定量PCR呈S型扩增曲线(图1);且不同稀释度之间的Ct值相差均匀,符合定量PCR的Ct值与起始拷贝数之间严格的线性关系(图2),因此,样本拷贝数与Ct值之间有良好的相关性。由于真菌DNA模板的浓度比较高,可能会对特异探针的扩增产生干扰和影响,为了保证检测结果的可靠性和准确性,结合多次重复实验分析,确定Taqman探针FAM-gx2鉴定F.moniliforme的gx2小种检测极限Ct值为32,即真菌的检测DNA的极限浓度为10pg/μl。